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摘自《廣西植物》

李辛雷,陳發(fā)棣

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇南京210095)

摘　要:生物技術(shù)的發(fā)展為花卉植物種質(zhì)資源的研究、創(chuàng)新及新品種培育提供了更多的途徑。該文對(duì)花卉植物的離體保存、分子標(biāo)記及細(xì)胞工程、基因工程在花卉植物種質(zhì)創(chuàng)新方面的研究進(jìn)展及取得的成果進(jìn)行了綜述,并對(duì)存在的問題及今后的發(fā)展方向進(jìn)行了探討,以期為相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞:花卉植物;生物技術(shù);遺傳育種

近年來,隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高,人們對(duì)花卉質(zhì)量的要求越來越高。傳統(tǒng)的育種方法逐漸表現(xiàn)出育種周期長、遺傳變異有限、引入某一優(yōu)良性狀的同時(shí)可能會(huì)伴隨一些不良性狀等局限性。生物技術(shù)作為一門新興學(xué)科,為傳統(tǒng)育種注入了新的活力,提供了全新的思路。在花卉植物種質(zhì)資源的保存與研究上,離體保存越來越體現(xiàn)其優(yōu)越性,而分子標(biāo)記已成為花卉植物生物技術(shù)方面最活躍、應(yīng)用最多的一項(xiàng)技術(shù)。利用生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新可以從細(xì)胞、基因水平定向改造生物,擴(kuò)大了育種范圍,提高了育種效率。

1　種質(zhì)資源保存

　　種質(zhì)保存(germplasmconservation)使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性,且有高活力的通過繁殖將其遺傳性傳遞下來。離體種質(zhì)保存是將植物外植體在無菌環(huán)境下進(jìn)行組織培養(yǎng),將這些外植體貯存在各類生長抑制條件下,使其緩慢生長或停止生長,以達(dá)到長期保存的目的,而后如果需要時(shí)可迅速恢復(fù)正常生長。相對(duì)傳統(tǒng)方法而言,離體保存所占空間小,基因型穩(wěn)定,受外界影響小,恢復(fù)快,易于控制。離體保存包括限制生長保存及低溫保存、超低溫保存。

1.1限制生長保存及低溫保存限制生長保存通常在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑如脫落酸(ABA)、矮壯素(CCC)、B9、PP333、6-BA等,或通過提高蔗糖濃度、加入甘露醇、山梨醇調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓,也有降低培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度來保存種質(zhì),另外控制光照和降低培養(yǎng)環(huán)境

的氧氣含量亦有利于限制生長保存。目前通過微繁及控制生長技術(shù)保存種質(zhì)的常用溫度范圍有3種:常溫(15~25℃)、常低溫(15~0℃)和低溫(0~-80℃)。陳菁瑛等(1998)在切花菊的試管苗保存時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加10mg/LB9有利于種質(zhì)離體保存,延緩生長作用較明顯,18個(gè)月時(shí)存活率仍達(dá)66·4%;2%甘露醇有利于離體保存,濃度升高時(shí)成活率下降;較弱的光照,菊花的光合作用減弱,有利于緩慢生長;常溫(25℃)處理全部死亡,4℃、6℃處理存活率僅10%,10℃、15℃的存活率分別達(dá)63·0%、58·7%,說明適當(dāng)降低溫度有利于提高菊花的存活率,且性狀正常。菊花植株在25~27℃培養(yǎng)環(huán)境中,當(dāng)氧的分壓(PO2)低于50mmHg時(shí)(正常大氣中氧分壓為152.0mmHg),隨著PO2降低,植株生長量降低,而且對(duì)植株的進(jìn)一步生長沒有影響(Bridgen等,1981)。史永忠等(2000)研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛試管苗在4℃黑暗條件下可連續(xù)保存12個(gè)月,并能恢復(fù)生長,1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基上的存活率高于MS。辛淑英和謝欣(1995)將由不定芽

再生的組培苗轉(zhuǎn)入16~18℃、光照1000lx和每天光照8h的低溫種質(zhì)庫中保存,結(jié)果表明附加甘露醇的MS培養(yǎng)基具有增加百合離體種質(zhì)存活率的作用,其中MS+甘露醇2%處理的效果最好,保存一年后的存活率高達(dá)92.9%。CPRO-DLO公司將百合活體在-2℃條件下貯存了3a,仍未喪失活力(Tuyl等,1996)。

1.2超低溫保存

超低溫(ultra-lowtemperature)通常指低于-80℃的低溫,主要是液氮(-196℃)及液氮蒸汽相,可降低甚至完全抑制其生活力及基因變異可能性,因此能夠保持生物材料的遺傳穩(wěn)定性,有利于解決組織、細(xì)胞繼代培養(yǎng)及自然界中積累性的突變等變異。目前超低溫保存正成為長期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源的有效手段。劉燕等(2001)對(duì)18個(gè)科47種花卉種子進(jìn)行超低溫保存研究,除了兩種花卉種子進(jìn)入液氮后炸裂外,其余45種花卉種子保存后都有一定發(fā)芽率,有些保存后種子發(fā)芽率還高于保存前。結(jié)果表明,超低溫保存技術(shù)可廣泛應(yīng)用于園林花卉種子保存,花卉種子自然含水量狀態(tài)即可存于液氮中,從液氮中取出后,35~40℃溫水浴化凍有較高的發(fā)

芽率。盡管超低溫保存已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但由于需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,實(shí)驗(yàn)的實(shí)際可操作性,物種的特性等原因,冷凍前后的遺傳穩(wěn)定性及保存后的再生能力等問題仍需解決,超低溫保存在花卉植物上的實(shí)際應(yīng)用仍有一段距離。

2　分子標(biāo)記應(yīng)用

作為基因型易于識(shí)別的表現(xiàn)形式,遺傳標(biāo)記(geneticmarkers)在植物種質(zhì)資源的研究和育種工作中有著十分重要的地位。目前,應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記有形態(tài)標(biāo)記(morphologicalmarkers)、細(xì)胞標(biāo)記(cytologicalmarkers)、生化標(biāo)記(biologicalmarkers)和分子標(biāo)記(molecularmarkers)。前3種標(biāo)記都是基因表達(dá)的結(jié)果,是對(duì)基因的間接反映,標(biāo)

記數(shù)目有限,多態(tài)性較差,易受環(huán)境條件的影響。而DNA分子標(biāo)記主要通過對(duì)供試材料DNA指紋圖譜比較分析后篩選出的特異帶進(jìn)行資源的鑒定,是DNA水平遺傳變異的直接反映。DNA分子標(biāo)記能對(duì)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、各個(gè)組織器官甚至細(xì)胞作檢測(cè),不受環(huán)境與基因表達(dá)與否的限制,數(shù)量極多,遍及整個(gè)基因組,多態(tài)性高,遺傳穩(wěn)定(Janssens,1995)。所以,DNA分子標(biāo)記從它誕生之日起,就引起了生物科學(xué)家極大的興趣。在短暫的幾十年中,經(jīng)歷了迅猛的發(fā)展,分子標(biāo)記日趨成熟。目前,DNA分子標(biāo)記已成為花卉植物生物技術(shù)方面最活躍的技術(shù)之一,廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析,種質(zhì)資源的系統(tǒng)演化及分類,基因的定位、分離測(cè)序及克隆,輔助育種,遺傳圖譜的構(gòu)建等方面,并顯示了獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)(Caetano,1995)。

2.1DNA分子標(biāo)記在親緣關(guān)系、系統(tǒng)演化及分類研究上的應(yīng)用

在花卉植物的分類、物種與品種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)演化等方面研究中,應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行的系譜分析可以提供分子水平的客觀依據(jù),比傳統(tǒng)方法更能反映其間的遺傳多樣性,有利于育種中親本的選配及資源的有效利用。目前,薔薇屬、菊屬、蓮屬、綠絨蒿屬、百合屬等類群已將RAPD分子標(biāo)記應(yīng)用到系統(tǒng)分類中。Hosoki等(1997)利用RAPD分析中國牡丹(ChineseTreepeony)栽培品種的遺傳關(guān)系,通過聚類分析揭示中國牡丹品種可大致分為4大類,但這些類別并非總是和葉型、花型或花色分類相一致。Jay等(1989)成功地對(duì)粉紅康乃馨品種進(jìn)行了鑒定。Jackson等(2000)運(yùn)用PCR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA,對(duì)菊花的一些群體進(jìn)行分子水平上的研究。Barcaccia等(1997)利用RAPD、AFLP對(duì)天竺葵屬植物進(jìn)行品種鑒定以區(qū)分表現(xiàn)型相似的個(gè)體。陳向明等(2001)對(duì)7種花色系的35個(gè)牡丹栽培品種進(jìn)行RAPD分析,發(fā)現(xiàn)同一花色的不同品種間和不同花色系間都存在較大的遺傳多態(tài)性。劉青林等(1999)曾用RAPD技術(shù)對(duì)梅花親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果表明梅與杏的親緣關(guān)系最近,與李較近,與山桃、毛櫻桃較遠(yuǎn)。施蘇華等(1998)應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)11種金花茶進(jìn)行了種間遺傳相似性分析,研究其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Hagit(1994)利用DNA指紋圖譜分析玫瑰的遺傳關(guān)系。陳新露等(1995)用RAPD技術(shù)分析了6個(gè)丁香(Syringa)品種間的遺傳關(guān)系,確認(rèn)了品種間的發(fā)展演化關(guān)系。戴思蘭等(1998)對(duì)菊屬26個(gè)分類居群間的親緣關(guān)系和7個(gè)野生菊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究,從分子水平上驗(yàn)證了現(xiàn)代栽培菊花(Dendranthemamorifolium)是以毛華菊(D.vestitum)、野菊(D.

indicum)種間天然雜交為基礎(chǔ),然后紫花野菊(D.zawadski)、菊花腦(D.nankingense)等又參與雜交,再經(jīng)過人工選擇形成的栽培雜種復(fù)合體。

2.2DNA分子標(biāo)記在花卉植物輔助育種上的應(yīng)用

在花卉植物輔助育種中,運(yùn)用DNA分子標(biāo)記可以進(jìn)行早期選擇,提高選擇的準(zhǔn)確度和育種效率,縮短育種周期。分子標(biāo)記輔助育種主要應(yīng)用于雜交親本的選配,遺傳轉(zhuǎn)化中目的基因的檢測(cè),遺傳變異的檢測(cè),遠(yuǎn)緣及體細(xì)胞雜種快速鑒定,無性系、不育系的鑒定,雜種純度的評(píng)估等�；ㄉ�的不穩(wěn)定表達(dá)是花卉植物轉(zhuǎn)基因存在的一個(gè)主要問題,Jain等(1998)對(duì)非洲菊的研究認(rèn)為,利用分子標(biāo)記技術(shù)可以有效鑒定變異是否可以穩(wěn)定遺傳。Kazvhisa等(1997)把葉綠體的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基(vbcl)基因和rRNA基因特殊區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用20多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的DNA限制性片段長度多態(tài)性的分析,成功地鑒定百合種間雜種。Malek等(1997)找到了與月季黑斑病菌抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記,以便在月季抗黑斑病菌育種過程中,可以通過分子標(biāo)記方法進(jìn)行輔助選擇,從而提高育種效率。王國良等(2001)使用RAPD

標(biāo)記技術(shù)對(duì)45個(gè)月季芽變品種進(jìn)行鑒別,為表型性狀極為相近的切花月季品種的分子鑒定提供了可靠的技術(shù)手段。吳紅芝等(2002)根據(jù)菊花B病毒(CVB)的外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)、合成引物,建立了CVB快速、靈敏、準(zhǔn)確的RT-PCR鑒定和檢測(cè)技術(shù)。

2.3DNA分子標(biāo)記在花卉基因定位、分離及克隆上的應(yīng)用

　　基因定位就是將具有某一表型性狀的基因定位于分子標(biāo)記的連鎖圖中,實(shí)現(xiàn)分子連鎖圖與經(jīng)典連鎖圖的整合。在分子標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展的同時(shí),產(chǎn)生了基于單標(biāo)記分析、區(qū)間作圖和復(fù)合區(qū)間作圖的QTL的統(tǒng)計(jì)模型,QTL定位研究隨之快速發(fā)展。Iuoras等(1998)利用RAPD分析來確定太陽花中那些與分枝隱性基因相關(guān)的標(biāo)記。荷蘭的植物育種與繁殖中心開發(fā)了RAPD分子標(biāo)記系統(tǒng),找到了與百合鐮刀菌抗性基因連鎖的RAPD分子標(biāo)記(Tuyl等,1996)。Holton等(1997)利用矮牽牛AFLP構(gòu)建的連鎖圖譜發(fā)現(xiàn),FLS基因(類黃酮合成基因)和F1連鎖,而F1位點(diǎn)是控制類黃酮合成的,表明F1是FLS的結(jié)構(gòu)基因。利用連鎖圖譜還對(duì)矮牽�；ㄖ锌刂粕�素P450酶的Hf1和Hf2基因進(jìn)行了定位(Holton等,1997;蔡友銘等,2002)。Dunemann等(1999)基于北美杜鵑的連鎖圖譜進(jìn)行QTL分析,對(duì)缺綠病和花色這些數(shù)量性狀進(jìn)行了定位研究。Scovel等(1998)利用RAPD分子標(biāo)記找到緊密連鎖康乃馨花型的位點(diǎn)標(biāo)記,然后將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換為RFLP標(biāo)記,它能100%準(zhǔn)確區(qū)分康乃馨的中國和美國群體的花型。劉志昕等(2001)已將建蘭花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白進(jìn)行了基因克隆并分析了基因序列,為今后的建蘭花葉病毒檢測(cè)工作奠定了基礎(chǔ)。張愛平等(1999)從香石竹上分離香石竹斑駁病毒,應(yīng)用RT-PCR合成并擴(kuò)增外殼蛋白基因cDNA。

2.4DNA分子標(biāo)記在花卉基因圖譜構(gòu)建上的應(yīng)用

遺傳圖譜(Geneticmap)又稱連鎖圖譜(Link-agemap),構(gòu)建遺傳圖譜是遺傳學(xué)研究中一個(gè)很重

要的領(lǐng)域,是對(duì)基因組進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ),也是在分子遺傳基礎(chǔ)上強(qiáng)化育種的依據(jù)�；�因連鎖圖在花卉基礎(chǔ)遺傳研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值。首先,它提供了有關(guān)性狀遺傳控制的信息,尤其對(duì)那些復(fù)合變異類型;其次,連鎖圖說明了性狀變異間的連鎖關(guān)系;第三,對(duì)于控制性狀的基因連鎖圖可以作為路標(biāo),指示對(duì)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)化�；ɑ苤参镞z傳圖譜的構(gòu)建已經(jīng)開展,如Holton等利用AFLP構(gòu)建矮牽牛(Petunia)連鎖圖譜(蔡友銘等,2002)。Dunemann等(1999)利用239個(gè)RAPD標(biāo)記,38個(gè)RFLP標(biāo)記和2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了北美杜鵑(Rhododendron)的分子連鎖圖譜;Sondur等在前人工作的基礎(chǔ)上,直接利用RAPD標(biāo)記構(gòu)建了番木瓜的遺傳圖譜;Pillay等(1996)用RAPD標(biāo)記研究啤酒花雜種一代的遺傳變異及分離情況,認(rèn)為其分離比例符合孟德爾遺傳規(guī)律,并分析了將其用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的可行性。

3　種質(zhì)創(chuàng)新

生物技術(shù)深入到細(xì)胞水平、基因水平來定向地改造生物,提高了育種的目的性和可操作性。生物技術(shù)在植物上的應(yīng)用,可打破種間雜交的障礙,擴(kuò)展遺傳物質(zhì)交流的范圍,為種質(zhì)創(chuàng)新提供了更有利的措施,使品種改良方法現(xiàn)代化和高效化。

3.1細(xì)胞工程

高等植物細(xì)胞在生理上的重要特性之一就是細(xì)胞全能性(totipotency),即在適宜的條件下,一個(gè)植物細(xì)胞可形成一個(gè)完整的植株。植物細(xì)胞工程就是在植物細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)上,利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)及其它遺傳操作,對(duì)植物進(jìn)行改良,選育有優(yōu)良性狀的新品種,保存具有重要價(jià)值或?yàn)l于滅絕的植物種類,使資源的創(chuàng)新達(dá)到一個(gè)新的水平。1902年Haberlandt提出細(xì)胞全能性概念,1958年Steward等用胡蘿卜(Daucuscarota)體細(xì)胞培養(yǎng)成功使其得到首次證實(shí)。

3.1.1單倍體育種　自1964年Guha等報(bào)道了從曼陀羅(Daturametel)首次成功誘導(dǎo)單倍體以來,觀賞植物中矮牽牛(Petuniahybrid)、郁金香(Tulipagesneriana)等均已獲得了單倍體植株。單倍體育種中應(yīng)用最多的是花藥培養(yǎng),即誘導(dǎo)未成熟花粉改變正常的配子體發(fā)育途徑,轉(zhuǎn)向雄核發(fā)育,再經(jīng)胚胎發(fā)育而形成單倍體植物的方法。花藥培養(yǎng)具有選擇效率高,快速利用新的種質(zhì)資源和縮短育種周期等優(yōu)越性。Arzate等(1997)在百合花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn):花粉接種時(shí)的發(fā)育時(shí)期比培養(yǎng)基更重要,單核小孢子早、中期比晚期易產(chǎn)生愈傷組織,冷處理及暗培養(yǎng)

有利于誘導(dǎo)愈傷組織。褚云霞等(2001)利用百合品種‘Pollyanna’單核期小孢子進(jìn)行花藥培養(yǎng)得到植株,經(jīng)染色體鑒定,有25%的單倍體存在。另外單倍體也可通過誘導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交、異源細(xì)胞質(zhì)、未授粉子房培養(yǎng)等方式來實(shí)現(xiàn)。Watannabe(1977)利用野生菊與栽培菊花(Chrysanthemummakinoi)2x(2n=18)×(Ch.shiwogikucv.Kinokuniense)10x(2n=90)、(Ch.makinoi)2x(2n=18)×(Ch.ornatum)8x(2n=72)遠(yuǎn)緣雜交后進(jìn)行胚拯救,分別得到染色體

數(shù)為2n=46和2n=37的雜種,被認(rèn)為是孤雄生殖,前者外部形態(tài)較母本更多地相似于父本,外部形態(tài)不同于父本的變異可能是由于母本的細(xì)胞質(zhì)遺傳。

3.1.2體細(xì)胞無性系變異的利用　

組織培養(yǎng)再生的植株中,存在廣泛的變異,稱之為體細(xì)胞無性系變異。體細(xì)胞無性系后代變異廣泛,穩(wěn)定快,能基本保持原品種的特性,這為新品系的選育提供了優(yōu)越條件。費(fèi)水章和周維燕(1994)利用菊花花蕾培養(yǎng),得到了具有變異的植株。裘文達(dá)和李曙軒(1983)利用菊花花瓣組培,培育出了3個(gè)新的品種。單細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境很敏感,一些外界因素(如射線、激光和離子束、冷熱處理、鹽脅迫等)很容易使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異,并且單細(xì)胞一旦發(fā)生無性系變異之后,細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、植株等各個(gè)階段都會(huì)保持這一變異特性,從而保證了再生植株的變異遺傳穩(wěn)定性,在較短時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的突變體。此外,變異的細(xì)胞(植株)在不同的外界因子脅迫下,將形成不同特性的無性系。體細(xì)胞變異的利用,可以得到常規(guī)育種中不易得到的變異類型,創(chuàng)建新的種質(zhì)資源�；ɑ苤参镉�種目標(biāo)的多元性,將使體細(xì)胞變異的應(yīng)用前景更為廣闊。

3.1.3幼胚拯救　

遠(yuǎn)緣雜交可以向栽培品種導(dǎo)入近緣種屬植物的優(yōu)良種質(zhì),提高栽培作物的抗性和品質(zhì),擴(kuò)大基因庫,實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新和培育新的優(yōu)良品種。但由于各物種間存在生殖隔離,不同的復(fù)雜遺傳基礎(chǔ),同源性差異,雙親生理上的不協(xié)調(diào),胚與胚乳的不親和及花器官形態(tài)、發(fā)育的差異等原因,使得遠(yuǎn)緣雜交很難得到種子,或者雜種種子不萌發(fā),或萌發(fā)后夭亡,屬、種間雜交成功率較低。利用生物技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交障礙,克服受精前不親和現(xiàn)象可利用體細(xì)胞雜交,而胚拯救技術(shù)被認(rèn)為是克服受精后障礙的有效手段。李容輝等(1992)通過對(duì)丁香雜交胚的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)幼胚培養(yǎng)能克服雜交種子的敗育現(xiàn)象,并且認(rèn)為花葉丁香與佛手丁香雜交胚離體培養(yǎng)的有效時(shí)期是授粉后85~95d。百合是花卉胚拯救的模式植物,Nakajima(1940)用簡單的糖溶液培養(yǎng)成功了Liliumspeciosum與L.auratum及L.spe-ciosum與L.japonicum雜交獲得的雜種胚。Asano

等(1977)提出百合胚拯救的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,并提出胚乳看護(hù)培養(yǎng)技術(shù)。子房切片培養(yǎng)與胚珠培養(yǎng)也是獲得遠(yuǎn)緣雜種的有效方法之一,當(dāng)胚很小時(shí)應(yīng)先進(jìn)行子房橫切片培養(yǎng)再進(jìn)行胚珠培養(yǎng)。Van等(1991)取百合柱頭切割授粉后7~40d的子房進(jìn)行切片,厚度為2mm,成功地獲得了種間雜種。Van等(1990)分別利用百合和郁金香胚珠培養(yǎng)獲得雜種。至今在花卉上,胚拯救已經(jīng)成功地應(yīng)用于鳳仙花屬、菊屬、蔥屬、鳶尾屬、郁金香屬、六出花屬、小蒼蘭屬、朱頂紅屬、馬蹄蓮屬等。

3.1.4原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交　

在植物生物技術(shù)育種中,原生質(zhì)體培養(yǎng)具有特殊意義,是細(xì)胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。原生質(zhì)體對(duì)外界環(huán)境很敏感,一些外界因素(如射線、激光、離子束、冷熱處理、鹽脅迫等)也很容易使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異,在較短時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的突變體。熊興耀等(1995)通過菊花莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織建立了細(xì)胞懸浮系,并酶解獲得了原生質(zhì)體。李名揚(yáng)等(1996)等利用直接酶解花瓣愈傷組織獲得原生質(zhì)體的方法實(shí)現(xiàn)了菊花植株再生,Lindsay等(1997)利用酶解菊花莖尖和幼嫩葉片產(chǎn)生原生質(zhì)體的方法實(shí)現(xiàn)了植株再生。體細(xì)胞雜交指用雙親的體細(xì)胞原生質(zhì)體或其衍生系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)融合,再經(jīng)培養(yǎng)、篩選、鑒定等步驟得到細(xì)胞雜種。原生質(zhì)體通過體細(xì)胞融合而獲得體細(xì)胞雜種,從而有效克服遠(yuǎn)緣雜交上的障礙,擴(kuò)大親本組合范圍,綜合不同物種的遺傳信息,豐富現(xiàn)有種質(zhì)資源。至今有50多種植物通過原生質(zhì)體融合得到的細(xì)胞雜種,以茄科、十字花科和蕓香科較多,禾本科、豆科和菊科植物也有報(bào)道。由于植物原生質(zhì)體具有再生植株的全能性,又排除了細(xì)胞壁的障礙,因此比其它類型的外植體更容易導(dǎo)入外源基因。王國英和賀普超(1994)用電擊法將nptⅡ基因轉(zhuǎn)入歐白英(Solanumdulcamara)的原生質(zhì)體,獲得轉(zhuǎn)基因植株。李國梁等(1999)對(duì)青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)葉和下胚軸原生質(zhì)體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。一些性狀改良基因或抗性基因可以通過PEG轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到原生質(zhì)體,然后再對(duì)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體培養(yǎng),獲得轉(zhuǎn)基因植株,以達(dá)到改良品種的目的。

3.2基因工程

植物基因工程技術(shù)指克隆一些特有性狀的基因,并通過生物、物理和化學(xué)等方法,導(dǎo)入到受體植物細(xì)胞,通過組織培養(yǎng)育出轉(zhuǎn)基因植物的生物技術(shù)。近年來,基因工程技術(shù)為觀賞植物性狀改良提供了全新的思路,成為最有前途的花卉育種新技術(shù)。與傳統(tǒng)育種手段相比,基因工程育種具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):可以定向修飾花卉的某個(gè)或某些性狀而保留其它原有性狀;通過引入外來基因可以擴(kuò)大基因庫。所以,通過基因工程完全有可能培育出一些新奇、獨(dú)特及具有各種目標(biāo)性狀的品種,大大縮短育種周期,提高育種效率�；�因工程在花卉植物育種中的應(yīng)用重點(diǎn)集中在花色、株型、抗性、花期等方面的改良上。Meyer等(1987)首次將源自玉米的編碼DQR的AI基因?qū)�入矮牽牛白花突變體中,產(chǎn)生了開磚紅色花的矮牽牛。美國加州奧克蘭DNA植物技術(shù)公司研究人員Courtney-Gutterson等(1994)用T-DNA作為載體將苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)以有義和反義方向?qū)�入開粉紅色花的菊花品種‘Moneymaker’中,獲得了133株有義植株和83株反義植株,其中各有3株開白花和淺粉色花,而剩余植株仍開粉紅色花。在開白色和淺粉色花的植株中由于cDNA與mR-NA結(jié)合,而使CHS活性降低,導(dǎo)致苯基苯乙烯酮前體物質(zhì)咖啡酸含量提高。白花植株通過無性繁殖仍能穩(wěn)定地遺傳,但后代開白花的植株中有一些花為粉紅色,這可能是反義RAN未能完全抑制CHS基因表達(dá)的緣故。Aida等(2000)用反義抑制法將CHS或DFR基因?qū)�入藍(lán)豬耳(Toreniahybrid),結(jié)果反義方向?qū)�入的轉(zhuǎn)化株花色均一變亮,而正義方向?qū)�入的轉(zhuǎn)化株花色不均一變亮。株形是花卉植物一個(gè)重要的形態(tài),如用于盆栽或地被用途的小菊,往往需要植株矮化、分枝性強(qiáng)、著花數(shù)目多等。Zheng等(2001)將煙草光敏色素基因?qū)�入菊花品種‘Kitau’中,獲得的轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照相比,其株型明顯矮化,而且分枝角度要比野生型大。可能是由于光敏色素合成引起GA3過量表達(dá),從而導(dǎo)致莖縮短,多分枝,這與人工噴施GA3取得的效果是相似的。Dolgov等(1997)將rolC基因?qū)�入菊花品種‘WhiteSnowdon’中,獲得二個(gè)轉(zhuǎn)化系,其中一個(gè)系與對(duì)照相比,表現(xiàn)為叢生、矮化,并且葉多分裂。Petty等(2000)把光敏色素基因phyA導(dǎo)入菊花中,發(fā)現(xiàn)菊花的花梗變短,葉綠素增加,并延緩衰老。Yu等(2000)將DOH1基因?qū)�入石�?SPAN lang=EN-US>(Dendrobiumnobile),轉(zhuǎn)基因植株分枝性強(qiáng)且矮化。抗性育種也是花卉育種的一個(gè)重要方面。Marchant等(1998)將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入現(xiàn)代月季中,轉(zhuǎn)基因植株黑斑病的發(fā)生率大大降低。Takatsu等(1999)將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)�入菊花品種‘Yam-

abiko’中獲得了抗灰霉病(Botrytiscinera)的轉(zhuǎn)化植株。Dolgov等(1995)將Bt中的δ-內(nèi)毒素基因?qū)�入再生能力很�?qiáng)的‘Bornholm’和‘WhiteHarri-come’菊花品種中,獲得轉(zhuǎn)化植株,在不噴施化學(xué)藥劑的情況下,植株表現(xiàn)出對(duì)扁虱(webtick)的抗性。Wordragen等(1993)以離體葉片為材料將Bt基因轉(zhuǎn)入到菊花品種‘Parliament’,獲得了抗蟲植株。Kamo等(1996)將菜豆黃斑病毒外殼蛋白基因(BYMVCP)和Gus基因轉(zhuǎn)入唐菖蒲的懸浮細(xì)胞中,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。Yepes等(1999)將編碼番茄斑萎病毒、鳳仙壞死斑病毒和花生環(huán)斑病毒外殼蛋白的基因?qū)�入菊花品種‘Polaris’、‘GoldenPola-ris’、‘Iridon’中,分別獲得了轉(zhuǎn)基因植物。在花期改良育種中,邵寒霜等(1999)克隆了調(diào)控花分生組織啟動(dòng)的相關(guān)基因—擬藍(lán)芥LFYcD-NA,然后轉(zhuǎn)化到菊花中,轉(zhuǎn)化后代有3株與對(duì)照相比其花期分別提前65d、67d和70d;另外有2株,

花期分別推遲78d和90d。Yu等(2000)用反義抑制法將DOH1基因?qū)�入石�?SPAN lang=EN-US>,獲得轉(zhuǎn)化株,其花期比對(duì)照早10d。Zheng等(2001)將PHYBI基因轉(zhuǎn)入菊花,轉(zhuǎn)基因植株LE31和LE32花芽分化比對(duì)照植株分別延遲4d和5d,而開花分別延遲17d和20d,表明PHYBI基因主要影響花芽發(fā)育而不是影響花芽分化。

4　結(jié)束語

我國被稱為“世界園林之母”,擁有豐富的花卉種質(zhì)資源,但我們對(duì)種質(zhì)資源的保存、研究與利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠�；ɑ芊N質(zhì)資源是遺傳育種的前提和基礎(chǔ),只有掌握了大量的育種材料,才能培育出新品種。植物生物技術(shù)使人類對(duì)種質(zhì)資源的保護(hù)、研究和利用達(dá)到新的水平,我們必須加大保護(hù)、搜集、整理和評(píng)價(jià)工作力度,充分發(fā)掘花卉種質(zhì)資源的優(yōu)異基因,加以科學(xué)合理的開發(fā)利用,使其為育種工作服務(wù)。同時(shí),花卉植物在長期的演化過程中,在自然選擇和人工選擇的雙重壓力下,形成了非常豐富的變異類型,遺傳背景較為復(fù)雜,其遺傳與生理生化特性的研究還有待深入。加強(qiáng)基礎(chǔ)性研究工作,拓展研究深度與廣度,如構(gòu)建遺傳圖譜,進(jìn)行重要性狀遺傳基礎(chǔ)研究,重要性狀相關(guān)基因定位、分子克隆等,將對(duì)花卉遺傳改良及種質(zhì)創(chuàng)新具有深遠(yuǎn)意義。生物技術(shù)育種是花卉育種的新技術(shù)、新領(lǐng)域、新方向,具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。生物技術(shù)在花卉植物上的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定成果,但與農(nóng)作物和其他園藝作物相比,仍有待深入。我們應(yīng)抓住生物技術(shù)帶來的發(fā)展機(jī)遇,充分利用我國豐富的花卉植物種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)及已經(jīng)取得的研究成果,結(jié)合我國花卉育種現(xiàn)狀,集中力量,從基礎(chǔ)工作做起,尤其在我國傳統(tǒng)特色花卉育種上重點(diǎn)突破,加強(qiáng)學(xué)科交叉,借助其他學(xué)科力量,加大應(yīng)用研究,逐步開展具有本國特色的花卉育種,振興我國花卉事業(yè)。